20bp
DNA ladder
● 產(chǎn)品編號及規(guī)格：
RTM441
50次 (250 μl)
● 產(chǎn)品組成：
|
貨號
|
名稱
|
規(guī)格
|
|
RTM441-01
|
20bp DNA ladder
|
50次（250 μl）
|
|
DL070
|
6×Native-PAGE DNA上樣緩沖液
|
1 ml
|
|
DL020
|
6×DualColor DNA
loading buffer (雙染料)
|
1 ml
|
● 產(chǎn)品簡介：
本產(chǎn)品是由13條帶狀雙鏈DNA條帶組成的精準(zhǔn)定量Marker，適用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中DNA條帶大小和含量的分析。13條帶的大小分別為20，40，60，80，100，120，140，160，180，200，300，400，500
bp。其中100bp和200bp條帶為加亮帶，含量為100ng/5μl，其余條帶濃度為50ng/5μl。
本產(chǎn)品為雙鏈DNA
Marker，適用于非變性的PAGE電泳和瓊脂糖凝膠電泳，不適用于尿素PAGE電泳。由于片段較小，如使用瓊脂糖分離，建議使用高分辨率瓊脂糖凝膠電泳分離。
按照每次上樣5
μl計(jì)算，該產(chǎn)品可以使用50次。
● 儲存條件：
-20℃ 貯存,有效期3年。
● 使用方法：
一、 TBE-PAGE凝膠分離：
1、制備凝膠步驟：
1.1參照凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。
1.2按照表一將不同體積的成分在小燒杯或試管中混合；最后加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
注：20bp DNA ladder 適用于配制20%TBE-PAGE膠。
1.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-2 cm的無水乙醇，使凝膠表面保持平整。
1.4靜置10-20分鐘，待分離膠和乙醇層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面后，說明凝膠已聚合
表一 TBE-PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于1mm厚度小板膠)
|
|
|
各組份體積（ml）
|
|
最佳DNA分離范圍
|
凝膠濃度
|
滅菌水
|
30%PAA（29：1）
|
5×TBE
|
10%APS
|
TEMED
|
|
70-450 bp
|
6%
|
3
|
1.0
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
|
60-460 bp
|
8%
|
2.66
|
1.34
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
|
50-300 bp
|
10%
|
2.33
|
1.67
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
|
40-200 bp
|
12%
|
2
|
2.0
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
|
25-150 bp
|
15%
|
0.5
|
2.5
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
|
5-100 bp
|
20%
|
0.66
|
3.34
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
1.5去除覆蓋在分離膠上的乙醇；按照表二將不同體積成分在一個(gè)小燒杯或試管中混合；最后加入10%過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
表二 TBE-PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml，適用于1mm厚度小板膠)
|
|
各組份體積（ml）
|
|
凝膠濃度
|
滅菌水
|
30%PAA（29：1）
|
5×TBE
|
10%APS
|
TEMED
|
|
4%
|
1.0
|
0.2
|
0.3
|
0.02
|
0.002
|
1.6將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達(dá)前玻璃板的頂端；將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
1.7靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會延長。可以根據(jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
2、電泳：
2.1 將凝膠板固定在電泳裝置上，往上槽和下槽中加入1×TBE電泳液，1 ml吸頭沖洗加樣孔1-2次。
2.2 取待測樣品，加入相應(yīng)體積6×Native PAGE DNA上樣緩沖液，如5 μl樣品加1 μl 上樣緩沖液，短暫離心后取5-10 μl上樣。 20bp DNA
ladder 1 mm厚10齒梳子上樣5 μl，其余梳齒和厚度凝膠適量調(diào)整上樣量。
2.3 連接電源線，打開電源開關(guān)。200V穩(wěn)壓電泳。至二甲苯菁指示前沿到達(dá)凝膠三分之二位置時(shí)結(jié)束電泳（此時(shí)溴酚藍(lán)指示前沿已經(jīng)跑出凝膠，不可見）。
|
TBE-PAGE電泳
|
|
恒電壓
|
起始電流
|
結(jié)束電流
|
電泳時(shí)間
|
|
200
V
|
20-25 mA/板膠
|
10-15
mA/板膠
|
70+min
|
3、染色：
3.1 漂洗：玻璃板上拆下凝膠后，適量蒸餾水漂洗3-5分鐘。
3.2 染色液配制：
TBE-PAGE膠可以使用EB或RealSafe類染料后染染色，以下程序用RealSafe Red核酸染料（貨號：GR002）進(jìn)行染色。即用型染色液配制：
|
|
即用型RealSafe核酸染色液
|
|
|
100 ml
|
|
1×TBE
|
100 ml
|
|
RealSafe Red核酸染料
|
20 μl
|
3.3染色和觀察：
凝膠浸泡于即用型染色液中，常溫避光搖床40-60 rpm染色30 分鐘。紫外光下觀察。
二、 瓊脂糖凝膠分離：
1. 瓊脂糖凝膠制備：
由于片段較小，建議選用高分辨率瓊脂糖（貨號AR1036）制膠。
以下步驟以制備50
ml 3%凝膠為例：
稱取1.5
g瓊脂糖于玻璃三角瓶中，加入50
ml 1×TAE，5 μl RealSafe Red核酸染料或其他核酸染料（如EB，GoldView），混勻，蓋好瓶蓋，微波爐中火加熱至沸騰，輕搖混勻，重復(fù)1-2次至瓊脂糖完全溶解，無可見顆粒。倒入制膠容器中，插好梳子，常溫凝固30-50分鐘至凝膠完全凝固。
2. 電泳：
取待測樣品，加入相應(yīng)體積6×DualColor
DNA loading buffer，如10 μl樣品加2 μl 上樣緩沖液，短暫離心后取5-10 μl上樣。 20bp DNA ladder 1 mm厚10齒梳子上樣5 μl，其余梳齒和厚度凝膠適量調(diào)整上樣量。
建議電泳條件：凝膠濃度為3％，電泳電壓8-10
v/cm（單位電壓指電泳槽陰陽極之間的距離電壓，如陰極陽極之間的距離為20 cm，可以用160-200
V電壓進(jìn)行穩(wěn)壓電泳），待溴酚藍(lán)指示前沿距離凝膠末端2 cm時(shí)終止電泳，電泳時(shí)間35-40分鐘。
注：3% 瓊脂糖TAE電泳中，溴酚藍(lán)大小約為20bp，二甲苯菁大小約200bp。
3. 紫外燈下觀察條帶。
注：使用EB或Goldview染料時(shí)，由于染料本身帶正電荷較多，隨著電泳時(shí)間的延長，染料會向陰極聚集，導(dǎo)致小片段核酸結(jié)合的染料含量降低，會出現(xiàn)小片段的DNA片段紫外燈下亮度變?nèi)趸虿豢梢姟４藭r(shí)可以將膠浸泡于含有染料的1×TAE緩沖液中染色15-20分鐘即可看到小片段。
4. 實(shí)驗(yàn)示例：
使用RTM441
20bp DNA ladder產(chǎn)品發(fā)表部分文章列表：
1. [2022 IF=6] A novel fuorescent sensor
based on aptamer recognition and DNA walker amplication strategy and its
determination of 17b-estradiol.
Author: Yajun Zhang, Licong Jia, Wei Wang,
Meng Jiang, Hongying Zhang, LingMei Niu
Marker: RTM441，20bp
DNA ladder
Journal: Arabian Journal of Chemistry. 16
(2023) 105340.
Institution：School of Public Health, Hebei Medical
University
Paper link：https://doi.org/10.1016/j.arabjc.2023.105340